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PKR2016 KAPA 第二代基因工程酶用戶指南

更新時(shí)間:2025-04-22      點(diǎn)擊次數(shù):74

PKR2016 KAPA 第二代基因工程酶用戶指南

——高性能Taq酶助力高通量PCR與基因組研究

一、產(chǎn)品概述

PKR2016 KAPA 第二代基因工程酶 是KAPA Biosystems(羅氏診斷旗下品牌)研發(fā)的高性能Taq DNA聚合酶,專為高通量PCR、長片段擴(kuò)增及二代測(cè)序(NGS)文庫制備設(shè)計(jì)。該酶通過直接分子進(jìn)化平臺(tái)優(yōu)化,具備超高保真性、抗抑制劑能力及擴(kuò)增長片段DNA的優(yōu)勢(shì),適用于復(fù)雜模板的擴(kuò)增與基因組學(xué)研究。

核心參數(shù)

  • 貨號(hào):PKR2016

  • 規(guī)格:100 units/支(可滿足50次50 μL反應(yīng))

  • 保存條件:-20℃避光保存,避免反復(fù)凍融

  • 有效期:24個(gè)月(未開封)

  • 適用領(lǐng)域:醫(yī)療衛(wèi)生、生物制藥、農(nóng)業(yè)育種、合成生物學(xué)等

二、技術(shù)優(yōu)勢(shì)

  1. 超高保真性

    • 錯(cuò)誤率:2.8×10??(通過大規(guī)模二代測(cè)序驗(yàn)證),顯著低于野生型Taq酶(1×10??)。

    • 應(yīng)用場(chǎng)景:適合SNP分型、基因編輯靶點(diǎn)驗(yàn)證、突變檢測(cè)等對(duì)保真性要求高的實(shí)驗(yàn)。

  2. 抗抑制劑能力

    • 耐受性:可耐受血液、土壤、糞便等樣本中的PCR抑制劑(如腐殖酸、血紅素、肝素)。

    • 優(yōu)勢(shì):無需復(fù)雜樣本預(yù)處理,直接用于臨床樣本、環(huán)境樣本的擴(kuò)增。

  3. 擴(kuò)增長片段DNA

    • 最大擴(kuò)增長度:基因組DNA可達(dá)15 kb,質(zhì)粒DNA或噬菌體DNA可達(dá)18 kb。

    • 應(yīng)用場(chǎng)景:全長cDNA合成、BAC克隆擴(kuò)增、長片段測(cè)序文庫制備。

  4. 高通量適配性

    • 反應(yīng)速度:擴(kuò)增速度較傳統(tǒng)Taq酶提升30%,適用于96孔板、384孔板自動(dòng)化操作。

    • 靈敏度:可檢測(cè)低至1個(gè)拷貝的模板DNA,適用于稀有樣本分析。

三、操作指南

(一)實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備
  1. 試劑與耗材

    • PKR2016 KAPA第二代基因工程酶(貨號(hào)PKR2016)

    • 引物(終濃度100-900 nM)

    • DNA模板(1 ng–1 μg,根據(jù)目標(biāo)片段長度調(diào)整)

    • PCR緩沖液(含Mg2?,無需額外添加)

    • 無核酸酶水

  2. 儀器設(shè)置

    • 預(yù)變性:95℃ 3分鐘

    • 30-40個(gè)循環(huán):95℃ 10秒 → 60℃ 30秒 → 72℃ 1分鐘/kb

    • 終延伸:72℃ 5分鐘

    • 溫度程序

    • 熒光通道:若結(jié)合熒光探針(如FAM、HEX),需選擇兼容的qPCR儀。

(二)實(shí)驗(yàn)操作
  1. 反應(yīng)體系配制(以50 μL體系為例):


    成分體積(μL)
    PKR2016酶(2 U/μL)0.5
    10×緩沖液5
    dNTPs(2.5 mM)4
    正向引物(10 μM)1
    反向引物(10 μM)1
    DNA模板1-100 ng
    無核酸酶水補(bǔ)足至50


  2. 加樣與離心

    • 使用單通道或多通道移液器加樣,避免氣泡。

    • 離心(2000 × g,1分鐘)確保液體沉至管底。

  3. PCR程序

    • 預(yù)變性:95℃ 3分鐘

    • 循環(huán):30-40個(gè)循環(huán)(95℃ 10秒 → 60℃ 30秒 → 72℃ 1分鐘/kb)

    • 終延伸:72℃ 5分鐘

(三)NGS文庫制備優(yōu)化
  1. 文庫擴(kuò)增

    • 使用PKR2016替代傳統(tǒng)酶,可提高文庫復(fù)雜度與覆蓋均一性。

    • 推薦反應(yīng)體系:25 μL(含10 ng文庫模板)。

  2. 質(zhì)量控制

    • 通過Qubit或Agilent Bioanalyzer檢測(cè)文庫濃度與片段分布。

(四)數(shù)據(jù)分析
  1. 擴(kuò)增效率驗(yàn)證

    • 標(biāo)準(zhǔn)曲線法:計(jì)算斜率(-3.32±0.1)確認(rèn)反應(yīng)效率(90%-110%)。

    • 熔解曲線分析:單一峰型表明特異性擴(kuò)增。

  2. 長片段擴(kuò)增驗(yàn)證

    • 使用λ噬菌體DNA(48.5 kb)測(cè)試擴(kuò)增能力,目標(biāo)片段長度≥15 kb。

三、使用技巧與高效操作

  1. 模板預(yù)處理

    • 對(duì)高GC含量模板(>65%)使用DMSO(5%-10%)或甜菜堿(1-2 M)輔助擴(kuò)增。

    • 對(duì)福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE)樣本,建議使用KAPA FFPE DNA修復(fù)試劑盒預(yù)處理。

  2. 引物設(shè)計(jì)

    • 引物長度18-25 bp,Tm值58-62℃。

    • 避免二級(jí)結(jié)構(gòu)與引物二聚體(使用Primer-BLAST或OligoAnalyzer評(píng)估)。

  3. 反應(yīng)條件優(yōu)化

    • 延伸時(shí)間:根據(jù)目標(biāo)片段長度調(diào)整(1 kb/分鐘)。

    • 退火溫度:通過梯度PCR確定最佳Tm值(±5℃)。

四、注意事項(xiàng)

  1. 安全規(guī)范

    • 避免反復(fù)凍融,分裝后保存于-20℃。

    • 操作時(shí)佩戴手套,避免RNA酶污染。

  2. 操作細(xì)節(jié)

    • 移液精度:使用校準(zhǔn)后的移液器,誤差<±1%。

    • 加樣順序:先加緩沖液與酶,再加引物和模板,最后加dNTPs與水。

  3. 故障排除

    • 無擴(kuò)增信號(hào):檢查引物質(zhì)量、模板濃度及反轉(zhuǎn)錄效率。

    • 非特異性擴(kuò)增:提高退火溫度或縮短延伸時(shí)間。

五、用戶評(píng)價(jià)與支持

  • 用戶反饋

    • “PKR2016顯著提高了長片段PCR的成功率,擴(kuò)增效率優(yōu)于競(jìng)品。"

    • “在FFPE樣本中,該酶的抗抑制劑能力顯著減少了優(yōu)化步驟。"



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